EJEMPLO DE TRANSGENICO EN DIABETES MELLITUS TIPO 2

EJEMPLO DE TRANSGÉNICO EN DIABETES MELLITUS (Tipo 2)

La predisposición a la resistencia insulínica o a la disfunción de células β se hereda de forma no Mendeliana, debido a su heterogeneidad genética y patogenia poligénica. Además, factores epigenéticos pueden modular las manifestaciones del genotipo. De manera que los estudios genéticos humanos acerca de la predisposición a la resistencia insulínica están plagados de incertidumbres y se ven aún más complicados por las considerables variaciones existentes en el pool genético humano.

Este es el motivo de que se hayan diseñado multitud de modelos animales (en su gran mayoría, ratones) transgénicos y knock-out, portadores de mutaciones en genes requeridos para la secreción y/o acción de la insulina, como método de análisis de un sistema genético de semejante complejidad.

Se sabe que los modelos animales utilizados en las investigaciones sobre la diabetes mellitus tipo 2, ayudan al estudio de los mecanismos patogénicos que conducen a la presentación de esta enfermedad, acompañada de severa o moderada hiperglucemia, intolerancia a la glucosa y otras alteraciones metabólicas relacionadas con la misma, y dan la oportunidad de explorar nuevos tratamientos y formas de prevenir estos cuadros.

Los ratones transgénicos transportan múltiples copias del gen de la insulina del hombre y muestran hiperinsulinemia basal crónica, una respuesta alterada a la insulina y a la glucosa, insulinorresistencia e intolerancia a la glucosa. Por  ejemplo, la secreción de insulina se interrumpe  en ratones machos que expresan oncoproteína humana H-ras y se manifiesta una  diabetes con elevadas concentraciones de calmodulina en las  células ß.

Los ratones transgénicos pueden expresar transgenes que incluyen receptores de insulina humana, transportadores de glucosa humana GLUT 4 y polipéptidos amiloideos de islotes humanos.

En estos  modelos animales, también se pueden estudiar otras alteraciones relacionadas con la DM2, las cuales se observan de forma espontánea o se inducen experimentalmente. Estas alteraciones generan  hiperinsulinemia  o hipoinsulinemia, cuyas manifestaciones son muy variables, pero típicamente incluyen trastornos  de la biosíntesis y de la secreción   de insulina, defectos en sitios específicos relacionados con la  secreción de insulina y cambios producidos por influencias ambientales.

VENTAJAS

• Alimentos con mejores y más cantidad de nutrientes.
• Mejor adaptación de las plantas a condiciones de vida más deplorables.
• Aumento en la producción de los alimentos con un sustancial ahorro de recursos.
• Aceleración en el crecimiento de las plantas y animales.
• Capacidad de los alimentos para utilizarse como medicamentos o vacunas para la prevención y el tratamiento de enfermedades.

DESVENTAJAS

• Incremento de sustancias tóxicas en el ambiente.
• Perdida de la biodiversidad.
• Contaminación del suelo.
• Resistencia de los insectos y hierbas indeseadas ante medicamentos desarrollados para su contención.
• Posibles intoxicaciones debido a alergias o intolerancia a los alimentos procesados.

BIBLIOGRAFÍA:

- Hugués Hernandorena B, Rodríguez García J, Rodríguez González J, Marrero Rodríguez M. Animales de experimentación como modelos de la diabetes mellitus tipo 2. Rev Cubana Endocrinol 2002;13(2):160-8. Disponible en: http://bvs.sld.cu/revistas/end/vol13_2_02/end09202.pdf

- Arias-Díaz J, Balibrea J. Modelos animales de intolerancia a la glucosa y diabetes tipo 2. Nutr Hosp. 2007;22(2):160-68. Disponible en: http://scielo.isciii.es/pdf/nh/v22n2/revision3.pdf

- Video disponible en: https://www.youtube.com/watch?v=Fm-3rc99N2E

Ejemplo de ADN Recombinante Artificial

EJEMPLO DE ADN RECOMBINANTE ARTIFICIAL O QUIMÉRICO EN LA DIABETES MELLITUS (Tipo 2)

La diabetes millitus es una de las enfermedades con mayor impacto en la sociedad. En esta enfermedad, los defectos la falta de insulina o resistencia a la misma son los principales involucrados. Por ello, en busca de tratamientos acertados, se ha llegado a la producción de insulina recombinante.

Las insulinas humanas se producen por técnicas de DNA recombinante y tienen diferente disponibilidad.

Una de esas técnicas se lleva a cabo a partir de organismos bacterianos. Se utilizan enzimas de restricción para cortar de manera abierta un plásmido, por lo que la misma enzima se utiliza para cortar el gen deseado fuera del cromosoma; esta reacción hace dos cortes que emparejan y cuando se combina el gen y el plásmido forman un enlace temporal. Otra enzima denominada ADN ligasa se utiliza para crear un sello permanente. De esta manera se induce a las bacterias que tomen los plásmidos mientras que estas mismas se desarrollan y se multiplican en el medio, generando la insulina de manera natural a partir de bacterias.

Existen otros dos tipos de insulina recombinante que han sido obtenidas mediante la utilización de otras técnicas moleculares. Estas son:

La insulina rápida: Es idéntica a la molécula nativa de insulina humana.
La insulina NPH: Es la versión de acción intermedia de la insulina rápida, a la cual se le adicionan cristales de protamina para retardar su acción.

En los últimos años, con técnicas de ingeniería genética, se han logrado desarrollar múltiples moléculas de insulinas modificadas. Estos análogos se obtienen a partir de la estructura primaria de la proteína, a la cual se le agregan o se le sustituyen residuos de aminoácidos, o bien, se unen a otras moléculas químicas, para modificar principalmente su velocidad de absorción y tiempo de acción, lo que ha permitido ofrecer al paciente esquemas mucho más fisiológicos de administración de insulina.

La aplicación de insulina en un paciente con diabetes tipo 2, habitualmente se inicia en combinación con hipoglucemiantes orales. En pacientes de edad avanzada o en aquéllos sin resistencia a la insulina o sobrepeso, las insulinas premezcladas se acompañan de un mayor riesgo de hipoglucemia.

BIBLIOGRAFÍA:

Lerman Garber I. ¿Son los nuevos análogos de insulina superiores a las viejas insulinas rápida y NPH?. Revista de Endocrinología y Nutrición Vol. 17, No. 2. Abril-Junio 2009 pp 62-65. Disponible en: http://www.medigraphic.com/pdfs/endoc/er-2009/er092a.pdf

Ejemplo de ADN recombinante en la Naturaleza

EJEMPLO DE ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA

RECOMBINACIÓN V(D)J

La recombinación V(D)J es un mecanismo de recombinación genética que se da en vertebrados por el cual se selecciona y ensambla al azar segmentos de genes que codifican proteínas específicas con papeles importantes en el sistema inmunitario. Esta recombinación específica de localización genera un repertorio diverso de receptores de linfocitos T (TCR) y moléculas de inmunoglobulina (Ig) que son necesarios para el reconocimiento de diversos antígenos bacterianos, víricos y de parásitos, así como de células disfuncionales, como son las tumorales.

MECANISMO DE RECOMBINACIÓN

- SECUENCIAS SEÑAL DE RECOMBINACIÓN:

Los genes regionales (V, D, J) se encuentran flanqueados por secuencias señal de recombinación (RSSs, por sus siglas en inglés) que son reconocidas por un grupo de enzimas conocidas colectivamente como VDJ recombinasa. Las RSSs están presentes en el lado 3' (secuencia abajo) de una región V y en el lado 5' (secuencia arriba) de la región J. Estos son los lados que están implicados en el empalme. Solo se recombinan eficientemente un par de RSSs espaciadoras que no sean idénticas. Esto se conoce como la regla del 12/23 de la recombinación.

- RECOMBINASA VDJ:
Es una colección de enzimas, algunas de las cuales son específicas de linfocitos, mientras que otras se expresan en muchos tipos celulares. Los pasos iniciales de la recombinación VDJ se lleva a cabo por enzimas críticas específicas de linfocitos, llamados recombination activating gene-1 y -2 (RAG1 y RAG2). Estas enzimas se asocian unas con otras para reconocer las secuencias RSS e inducir una escisión del ADN en ellas. Esto solo tiene lugar en una de las cadenas de ADN, lo cual conduce a un ataque por nucleótido y la creación de un motivo estructural en bucle.
Otra de estas enzimas se llama complejo proteín quinasa activada por ADN (DNA-PK) que repara el ADN de doble cadena. Este complejo se une a cada uno de los extremos del ADN escindido, y recluta varias proteínas más incluidas varias ADN polimerasas 

ENFERMEDADES ASOCIADAS CON DEFECTOS EN RECOMBINACIÓN V(D)J

El Síndrome de Omenn es asociado con mutaciones en los genes que son necesarios para la síntesis de RAG1 y RAG2. La condición resulta en una inmunodeficiencia combinada severa.

BIBLIOGRAFÍA:

Parham P. Inmunología. Ed. Panamericana. Buenos Aires: 2005. (Fecha de consulta: 27-11-2015) Pag: 62. Disponible en: https://books.google.com.ec/books?id=IX3Sqib_1ooC&pg=PA62&lpg=PA62&dq=recombinaci%C3%B3n+v+d+j&source=bl&ots=kz_fGrEcFB&sig=wT4nfc1N3kcxcQ3gj1UGnKRUwdM&hl=es-419&sa=X&sqi=2&ved=0ahUKEwih0bH97c3JAhUGQSYKHbVoAcAQ6AEIWTAM#v=onepage&q=recombinaci%C3%B3n%20v%20d%20j&f=false

Prueba molecular para diabetes mellitus II

UNA PRUEBA MOLECULAR PARA DIABETES MELLITUS (Tipo 2)

Los mecanismos moleculares del desarrollo del páncreas no son completamente conocidos, sin embargo varios factores de diferenciación y factores transcripcionales han sido identificados como cruciales para la organogénesis y diferenciación pancreática, tal es el caso de Pax4 que se expresa en las etapas tempranas del desarrollo pancreático, posteriormente es restringido a células β permaneciendo así hasta la edad adulta.

Con este conocimiento, es posible buscar, mediante métodos moleculares, mutaciones en factores de transcripción clave para la diferenciación y regulación de células pancreáticas que predisponen al desarrollo de diabetes mellitus tipo 2.

Ejemplo: Un estudio realizado para evaluar molecularmente el gen Pax4 en 2 grupos de estudio: 50 controles sanos y 50 pacientes con Diabetes mellitus 2 de inicio temprano en población mexicana.

Muestra biológica: Sangre periférica

Gen: PAX4

Extracción de ADN:

A partir de leucocitos de sangre periférica con técnicas estándar.

PCR:

Amplificación de 9 Exones de PAX4 mediante PCR con ADN genómico y oligonucleótidos específicos. 

SSCP: 

Las diferencias de corrimiento electroforético en la cadena simple del ADN, se evaluaron en cada sujeto para detectar variantes de secuencia.

Secuenciación: 

Cada patrón de migración diferente detectado por SSCP, se secuenció en un secuenciador.

PCR-RFLP: 

Las frecuencias de las mutaciones encontradas se determinaron por PCR-RFLP

RESULTADOS:

El estudio molecular del gen Pax4 reveló la presencia de dos variantes de secuencia en población mestiza mexicana. Los polimorfismos R133W y P321H pueden ser parte del fondo genético diabetogénico de dicha población.

BIBLIOGRAFÍA:

- Montúfar-Robles I, Ortiz-López M, Menjívar-Iraheta M. Detección molecular de variantes de secuencia  del gen PAX4 en pacientes con Diabetes mellitus tipo 2 de inicio temprano del Hospital Juárez de México. Rev Med Grap Artem. 2006;31(7):69. Disponible en:
http://www.medigraphic.com/pdfs/bioquimia/bq-2006/bqs061h.pdf

Segundo hemisemestre

SEGUNDO HEMISEMESTRE BIOLOGÍA MOLECULAR 2016-2016 

Pruebas de tamizaje para detección de diabetes mellitus

Pruebas de tamizaje para detección de diabetes mellitus

Primeramente debemos conocer que una prueba de tamizaje, también llamada de screening, es un método para identificar en una población sana a individuos que padezcan alguna enfermedad sin presentar síntomas, son menos complejas que las pruebas confirmatorias para la enfermedad. 

Analizaremos 2 pruebas de tamizaje:

     * Examen de glucemia

Es un examen que mide la concentración de glucosa en la sangre, podemos tomar como referencia:

Para definir si el resultado es normal o no, se establecieron escalas o umbrales:

Por debajo de los 70 ml/dl: si el valor es inferior a 70, se dice que hay hipoglucemia, es decir, el nivel de glucosa en sangre está por debajo de lo normal.

Entre 70 y 110 ml/dl: si el resultado oscila entre estos dos umbrales, entonces la glicemia del paciente es normal.

Entre 110 y 126 ml/dl: este rango recibe el nombre de “glucosa alterada en ayuno”. Puede considerarse que el paciente está en un estado de prediabetes, y existe cierto riesgo de desarrollar diabetes tipo II.

Por encima de los 126 ml/dl: cuando el resultado indica 126 o más miligramos de glucosa en sangre, entonces el médico puede diagnosticar diabetes.

  * Prueba de tolerancia a la glucosa (PTOG)

La prueba de tolerancia oral a la glucosa (PTOG) consiste en la medición de la glucemia dos horas después de dar una carga oral de 75 gramos de glucosa.

Para la realización de la PTOG la persona debe ingerir 75 gramos de glucosa diluidos en 300 ml de agua con o sin sabor, a temperatura ambiente, en un período no mayor de cinco minutos. Además debe reunir las
siguientes condiciones:

- Ayuno de ocho a 14 horas (se puede tomar agua)

- Evitar restricciones en la dieta durante los tres días precedentes (consumo mínimo de 150 gramos de hidratos de carbono al día). La evidencia reciente sugiere que es conveniente consumir la noche anterior una comida con un contenido razonable de carbohidratos (30-50 g)

- Evitar cambios en la actividad física habitual durante los tres días precedentes

- Durante la prueba debe mantenerse en reposo y sin  fumar.

- Es preferible que no tenga una infección u otra enfermedad intercurrente. De lo contrario, debe quedar consignada en el informe de la prueba.

- Debe interrumpir el consumo de medicamentos que pudieran alterar los valores de la glucemia mínimo 12 horas previas a la realización de la prueba. De lo contrario, deben quedar consignados en el informe de la prueba

- La PTOG no se debe practicar en pacientes con VIH positivo que estén recibiendo inhibidores de proteasas por el alto número de resultados de glucemia falsamente positivos.

- En niños la PTOG rara vez se utiliza, pero cuando se requiere la carga de glucosa se calcula con base en 1.75 g por kg de peso sin exceder 75 g en total.  

Fuentes bibliográficas:

http://www.uacj.mx/ICB/RedCIB/MaterialesDidacticos/Monografas/Pruebas%20de%20Tamiz.pdf   

http://www.diabetes.co.uk/

http://www.planetadiabetes.com/examen-de-glucemia-solo-en-ayunas/

http://apuntesmedicos.net/2008/05/27/diagnostico-de-la-diabetes-mellitus-y-otros-problemas-metabolicos-asociados-a-regulacion-alterada-de-la-glucosa/